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新春礼物:晶能生物10x空间转录组服务全面开启!
发布日期:2019-12-31浏览:

晶能生物10x Visium空间转录组,一经发出,引爆市场。千呼万唤始出来,我们终于迎来空间转录组配套试剂。

 

为了便于各位老师进行课题设计和样本准备,及早发表高分文章,今天小编就再次给大家梳理一下10x Visium空间转录组的完整流程。

 

10x Visium空间基因表达解决方案是一整套简单易行的工作流程,从样本准备开始到数据分析都有详细的说明文档。该解决方案包含两个试剂盒:组织优化试剂盒和空间转录组试剂盒,分别用于组织透化时间的优化和正式实验。

其主要步骤包括以下四个部分:

1.样本准备,

2.组织优化,

3.空间转录组建库及测序,

4.数据分析。

 

1 样本准备

跟单细胞转录组类似,空间转录组的样本准备也非常重要,会极大的影响后续的结果。所以样本准备一定要非常谨慎,严格按照要求来做。样本准备的主要内容和步骤如下:组织速冻→OCT包埋→组织切片→RNA质控。

                

 

下面,我们就样本准备流程进行详细阐述。

A. 组织速冻

空间转录组的研究需要新鲜冻存组织。手术得到新鲜样本后,可用PBS冲洗,去除残留血液,随后将组织表面多余的血液或液体吸干净。然后将装有异戊烷的金属容器放入液氮中冷冻,用镊子或小铲子将组织浸没于异戊醇,直到组织冻结。取出组织转移到预冷的密封容器中,干冰转移至-80°长期保存。这步需要注意的是一定要吸干组织表面的液体,不然会形成冰晶影响后续实验。冻存组织后可以干冰运输到公司,进行后续实验。

 

B. OCT包埋

有条件的老师也可以自行进行OCT包埋。在包埋之前一定要注意组织的空间摆放位置,这点对后续切片很重要。确定好组织空间方位后,将组织放入OCT包埋剂中,组织需完全浸没,并确认无气泡产生。等待OCT完全冻结之后可以将包埋好的组织块放入密封容器中,-80°长期保存。同样,包埋好的组织也可以通过干冰运到公司,进行后续实验。

 

C. 组织切片

组织切片这步建议送到公司做,因为这步不同于普通的冰冻切片,需要将组织切片贴到组织优化玻片或空间转录组玻片上才算完成。这一步需要操作非常熟练,才能保证组织切片一次贴上载玻片的捕获区域。如果一次贴的不好,就很难再修改了。切片过程中温度的控制也很重要,所有用的东西都需要预冷,而且所有的操作都建议在设定好温度的切片机中进行。将组织切片贴到玻片上之后,也可以-80°密封保存,但最多只能保存一周。对于较大的组织样本需要进行划分以生成适合捕获区域大小的较小样本,然后再进行切片。 划分组织时,用预冷的刀片在组织表面划一个浅切口(约 1mm深),深切口可能会导致组织损伤和不完整。

 

D. RNA质控

在进行后续实验之前,会有一步关键的质控:RNA质量完整性的评估。准备10张切片,用微量抽提试剂盒抽提RNA后,可用Agilent 2100 进行 RIN 值检测,通常认为RIN>7的RNA质量较好。

 

总结一下,样本准备非常关键,需要注意每一步的细节,准备的时候越严谨越好。

这里面有几点需要特别注意:

a. 冻存组织之前尽量吸干组织表面的液体,防止形成冰晶。

b. 包埋前要先确定好组织的空间方位,便于后续的切片和研究。

c. 样本准备的过程中注意温度的控制,可以防止RNA降解和切片异常。

d. 较大的组织样本在切片前需要进行组织划分,以生成适合捕获区域大小的样本。

e. RIN值的检测是关键的一个质控点,可用来确定样本是否可以进行后续实验。

 

2 组织优化

对于第一次进行实验的样本,都需要做组织优化。组织优化的目的是找到最佳的透化时间,以便正式实验得到最好的效果。组织优化玻片包含8个捕获区域,可同时设置7个不同的透化时间,其中一个为不加透化剂的阴性对照。其实验流程为:固定-染色-明场拍照-组织透化-荧光cDNA合成-组织移除-荧光扫描,根据荧光强度判断最优的透化时间。其原理是在反转录的时候加入了荧光标记的核苷酸,用于cDNA的合成,通过荧光强度的强弱就可以反映透化后释放出RNA的量。

 

下图右侧是组织优化的示例结果,左上角第一个区域为阳性对照,不放组织切片,而是直接加入RNA,肯定带有荧光。而右下角0分钟的区域为不加透化剂的阴性对照,不发荧光。其余的样本设计了不同的透化时间,结果表明12分钟的时候,荧光强度最强,所以这个透化时间最优。需要注意的是,如果两个时间点的荧光强度相同,一般会选择透化时间更长的时间点。

   

组织优化步骤及示例结果

 

3 空间转录组建库及测序

空间转录组玻片包含4个捕获区域(6.5 x 6.5mm),可做4个样本。这四个区域可以做同一个样本的重复,也可以做不同类型的样本。其简单的验流程是:固定,染色以及明场拍照→组织透化及cDNA合成→二链合成→cDNA扩增→文库构建→高通量测序。正式实验相当于在组织优化的步骤上继续往下完成文库的构建和测序。做好前面的样本准备和优化工作后,这部分出问题的概率就不大了。需要注意的是测序数据量的确定,目前推荐每个spot测50k的read pairs,但是一般切片得到的组织不会覆盖整个捕获区域,所以需要根据组织覆盖区域进行计算。如下图,根据样本所占面积的百分比,就可以计算总的测序深度了。例如,覆盖50%的区域的话,推荐检测的数据量就是5000(总的spot)x 50000(每个spot数据量)x 0.5(覆盖面积)= 125M read pairs。

组织覆盖百分比示例

 

4 数据分析

由于国内实验还没有正式开展,所以还没有正式的空间转录组下机数据用于分析。我们已经利用10x官网上的demo数据,对空间转录组分析流程进行了测试,一旦有数据下机就可以正式分析。目前使用的分析软件主要是Space Ranger 1.0.0,输入的文件除了常规的下机数据,还需要前期HE染色的图片,JPG和TIFF格式的都可以。通过分析主要可以得到基因表达矩阵和空间转录组的聚类结果,且可以对不同类型细胞进行差异表达分析。通过可视化软件Loupe Browser 4.0.0可以对分析得到的结果进行更精细的比较和分析。除了用于后续的分析之外,Loupe软件还可以对space ranger无法处理的图片进行手动基线校正,确保大部分染色结果都可以进行后续分析。

示例的分析结果如下:

 

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